2. INTRODUCCION La luz, como fuente de energía para la fotosíntesis, es el prerrequisito esencial para la vida de las plantas. Sin embargo, el exceso de luz, puede disminuir la fotosíntesis (fotoinhibición) y llevar a la destrucción fotooxidativa de los aparatos fotosintéticos (Long & Humphries, 1994), además de causar efectos inhibitorios en la asimilación de CO2 (Krause, 1988). La fotoinhibición puede ser definida como la inhibición de la fotosíntesis cuando el flujo de fotones que llega a la planta excede el requerimiento fotónico de ésta (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Krause, 1988; Öquist & Huner, 1991; Heber & Walker, 1992; Gray et al., 1994; Long et al., 1994; Adams III et al., 1995a; Huner et al., 1996). La fotoinhibición de la fotosíntesis se presenta como una disminución del rendimiento cuántico para el intercambio de CO2 y O2, un aumento en la fluorescencia de la clorofila a (Chl a), y una disminución de las tasas de fotosíntesis a saturación lumínica, bajo exposición prolongada a luz excesiva (Demmig & Björkman, 1987; Demmig et al., 1987; Krause, 1988; Ögren, 1988; Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Gray et al., 1994; Long et al., 1994). El proceso fotoinhibitorio se basa principalmente en una inactivación del sistema transportador de electrones en los tilacoides, cuyo efecto dominante es la alteración de los centros de reacción del fotosistema II (PSII), lo que conduce a un descenso de la eficiencia fotoquímica primaria de la fotosíntesis (Krause, 1988). La energía lumínica, capturada por las clorofilas y carotenoides del complejo antena tilacoidal, es transferida al centro de reacción del PSII, donde la separación de cargas inducida por fotones tiene lugar entre el aceptor y dador primario de electrones. El complejo PSII es uno de las multi-subunidades de los tilacoides, y está compuesto por más de 30 proteínas codificadas por genes nucleares y del cloroplasto (Barber, 1998; Yamamoto, 2001). De entre las proteínas intrínsecas codificadas por el cloroplasto, las D1 y D2 con una masa molecular de 32 kDa, son de particular importancia. En ellas se localizan los componentes redox requeridos para la reacción fotoquímica, como ser, el dador primario de electrones P680, el aceptor primario de electrones feofitina (Pheo), el dador secundario de electrones Tyr Z (tirosina con actividad redox de la proteína D1) y los aceptores secundarios de electrones quinona A (QA) y quinona B (QB) (Fig. 1). Bajo iluminación excesiva de luz visible, la proteína D1 se convierte en blanco de fotodaño, el cual inhibe el transporte de electrones en el fotositema II (Yamamoto, 2001). Este daño se traduce en la degradación de esta proteína por acción del oxígeno singlete (1O2), especies oxidativas como P680+ y Tyr Z+, las cuales producen cortes en loops de la proteína (De las Rivas et al., 1992) y cambios conformacionales en el sitio de unión a QB (Nakajima et al., 1996). También se forman aductores covalentes o agregaciones de la proteína con los polipéptidos que la rodean, debido a la oxidación de amino ácidos de la proteína D1. Estas agregaciones son digeridas por putativas proteasas estromales (Yamamoto, 2001). La disfunción y degradación de la proteína D1 (proteína de unión al centro de reacción del PSII), ha sido sugerida como el sitio inicial causante de fotoinhibición (Krause, 1988). Además del exceso de luz, otros factores de estrés ambiental tales como temperaturas bajas y de congelación, calor, sequía y la deficiencia de nitrógeno pueden conducir e intensificar la fotoinhibición aún con luz moderada (Larcher & Neuner, 1989; Somersalo & Krause, 1989, 1990b; Greer et al., 1991; Brestic et al., 1995; Dannehl et al., 1995; Fryer et al., 1995; Giardi et al., 1996; Havaux & Tardy, 1996; Maury et al., 1996). Sin embargo, en algunas plantas, la aclimatación al frío contribuye a disminuir la sensibilidad a la fotoinhibición ante un estrés de enfriamiento (Somersalo & Krause, 1989, 1990a, 1990b). FIGURA 1. Diagrama esquemático de la estructura del fotosistema II. Se muestra la localización relativa de las proteínas D1 y D2 (proteínas de unión al centro de reacción del PSII, de masa molecular 32 kDa), CP43 y CP47 (proteínas de unión a clorofila antena de masa molecular relativa de 43 y 47 kDa) y OEC33, OEC24 y OEC18 (subunidades del complejo liberador de oxígeno de 33, 24 y 18 kDa), QA y QB (plastoquinona aceptora de electrones primaria y secundaria del PSII), TyrZ (tirosina con actividad redox de la proteína D1), Pheo (feofitina), cluster de Mn (4Mn) y P680 (dador primario de electrones), además del complejo captador de luz II (LHCII) y citocromo b 559 (Cyt b 559 ). Basado en las referencias de Mori et al., (1995); Yamamoto & Akasaka, (1995); Yamamoto et al., (1998), citadas por Yamamoto, (2001). 2.1. Fotosíntesis y fotoinhibición a bajas temperaturas y alta luminosidad La fotosíntesis es uno de los procesos fisiológicos más sensibles a la temperatura (Berry & Björkman, 1980; Huner et al., 1993). La fotosíntesis se inhibiría a baja temperatura, por la reducción en la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente, por una disminución en el transporte de electrones del PSII, causada por daños en el centro de reacción del mismo fotosistema y por un incremento de la velocidad de disipación no radiativa (emisión de calor) de la energía de excitación (Demmig et al. 1987; Krause, 1988; Baker, 1991; Brüggemann & Dauborn, 1993; Huner et al., 1993; Rintamäki et al., 1995). El transporte de electrones mediado por el fotosistema I (PSI) no es significativamente fotoinhibido (Moll & Steinback, 1986; Huner et al., 1993; Hurry et al., 1994). La fotoinhibición a bajas temperaturas ha generado un alto interés en los últimos años y ha sido extensivamente investigada bajo condiciones de terreno (Ögren, 1988; Ögren & Sjöstrom, 1990; Somersalo & Krause, 1990b; Groom et al., 1991; Karpinski et al., 1994; Adams III et al., 1995b; Steffen et al., 1995; Lütz, 1996) y de laboratorio (Somersalo & Krause, 1990a; Falk & Palmquist, 1992; Krause et al., 1995). Aunque muchos investigadores han expresado la fotoinhibición de la fotosíntesis como daño del PSII, las investigaciones actuales demuestran que no siempre se produce daño del aparato fotosintético cuando éste se fotoinhibe, y que la caída en el rendimiento cuántico del PSII estaría asociado a fenómenos de fotoprotección (Krause, 1988; Huner et al., 1993; Öquist et al., 1993; Horton et al., 1996). La extensión de la fotoinhibición varía con el estado fisiológico de la planta y las condiciones ambientales, tales como densidad del flujo fotónico (PFD) y duración de la exposición a la luz (Powles, 1984; Krause, 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992). A baja temperatura las plantas son más sensibles a la luz, produciéndose fotoinhibición a intensidades de luz menores que a mayor temperatura (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Schöner & Krause, 1990; Mishra et al., 1993). En algunas plantas, el daño producido puede mantenerse aún cuando la temperatura óptima de crecimiento se restablezca (Park et al., 1995). Como se indicó anteriormente, el sitio primario de daño fotoinhibitorio del PSII sería la proteína D1 de 32 kDa, la cual se denatura y separa de la membrana tilacoidal (Krause, 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992; Horton et al., 1996; Nishida & Murata, 1996). Con ello se inactiva la transferencia electrónica y la proteína se hace susceptible a la acción de proteasas o especies de oxígeno activo (Powles, 1984; Krause, 1988; Somersalo & Krause, 1989; Schöner & Krause, 1990; Wang et al., 1992; McKersie et al., 1993; Long et al., 1994; Zhang et al., 1995; Hakam & Simon, 1996; Hippeli & Elstner, 1996; Kocsy et al., 1997; Yamamoto, 2001). Sin embargo, no existe aún consenso que éste sea el único sitio de daño, ya que se ha encontrado fotoinhibición del transporte de electrones sin pérdida de D1 (Krause, 1988; Long et al., 1994). En hojas aclimatadas al frío la fotoinhibición y su recuperación tampoco involucran a esta proteína (Critchley & Russell, 1994). Plantas sensibles a las bajas temperaturas, fotoinhibidas por estrés frío, muestran una alta reducción del “pool” de plastoquinonas y en especial de la quinona A, con incremento en el cierre de los centros de reacción (CR) y una marcada disminución y degradación en los complejos proteína-pigmentos del PSII (Klosson & Krause, 1981; Wise & Naylor, 1987; Koroleva et al., 1994; Hodges et al., 1996; Fadzillah et al., 1996). Se ha reportado que, mientras la respuesta fotoinhibitoria es muy marcada en plantas susceptibles al frío, plantas resistentes a este factor, poseen mecanismos que las capacitan para evitar o reducir el bloqueo fotosintético, y por ende, mantener la integridad funcional de los cloroplastos (Steffen et al., 1989). Somersalo y Krause (1989, 1990) fueron los primeros en informar que hojas de espinaca (Spinacia oleracea) aclimatadas al frío exhiben una alta capacidad de tolerar la fotoinhibición (Huner et al., 1993; Gray et al., 1994). Aunque plantas de espinaca no aclimatadas se fotoinhiben, este fenómeno es potencialmente reversible en el tiempo (Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Schöner & Krause, 1990), como también se ha reportado para otros vegetales (Ting et al., 1991). Cereales de primavera, con baja resistencia al frío, no son capaces de resistir la fotoinhibición durante crecimiento prolongado a bajas temperaturas (temperaturas no congelantes), como ocurre en plantas resistentes al frío, como trigo o centeno de invierno (Öquist & Huner, 1991; Huner et al., 1993; Öquist et al., 1993; Huner et al., 1996; Szalai et al., 1996). El incremento en la resistencia a la fotoinhibición en los cereales de invierno es el reflejo de la capacidad de mantener las QA oxidadas, bajo condiciones de alta irradiancia y baja temperatura (Öquist & Huner, 1991; Huner et al., 1996; Savitch et al., 1997). Esta capacidad ha sido relacionada con el aumento en la tolerancia al congelamiento en estas plantas (Öquist et al., 1993). Sin embargo, estos autores también reportan, que la alta resistencia al frío exhibida por plantas de pino aclimatadas a bajas temperaturas, no está relacionada con esta capacidad, ya que estas especies vegetales se fotoinhiben en condiciones de frío y luz moderada. Todo lo anterior, muestra que la respuesta de las plantas a factores ambientales capaces de provocar fotoinhibición es variable. No sólo plantas vasculares, sino plantas no vasculares como musgos y líquenes antárticos expuestos a bajas temperaturas y alta luminosidad, son capaces de mantener su capacidad fotosintética gracias a la mantención de una mayor actividad del PSII ante el efecto de estos factores ambientales (Huner et al., 1993; Davey & Rothery, 1996; Edwards & Smith, 1988; Casanova, 1997). Se considera que la posibilidad de recuperación en el tiempo, de plantas que han sufrido eventos fotoinhibitorios bajo frío y que son devueltas a condiciones óptimas, está íntimamente relacionada con la capacidad del PSII de disipar la energía no radiativa como calor (a través del ciclo de las xantofilas), con o sin intervención de la proteína D1. Esta capacidad de recuperación sería reflejo de que están operando procesos de fotoprotección (Demmig et al., 1987; Greer et al., 1991; Demmig-Adams & Adams, 1992; Heber & Walker, 1992; Long et al., 1994; Brestic et al., 1995; Fryer et al., 1995; Adams et al., 1996; Demmig-Adams & Adams, 1996; Flanigan & Critchley, 1996). Cambios bioquímicos en el contenido y composición de los complejos proteína-pigmentos del centro de reacción y/o de las antenas, permiten minimizar el daño fotoinhibitorio, manteniendo la eficiencia de los eventos primarios de la fotosíntesis, proceso conocido como “down-regulation” (Huner et al., 1984; Sicher et al., 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992; van Wijk & van Hasselt, 1993; Maxwell et al., 1995; Haldimann, 1996; Horton et al., 1996; Jahns & Miehe, 1996; Park et al., 1996; Gilmore, 1997). Todos estos mecanismos de desexcitación del sistema tilacoidal, pueden afectar la emisión de fluorescencia de la Chl a, cuyos parámetros son utilizados como indicadores del efecto fotoinhibitorio de diversos tipos de estrés sobre plantas. El significado de la emisión de diferentes señales de fluorescencia y su importancia en la predicción de fotoinhibición será tratado más adelante (punto 2.3). 2.2. Carotenoides y su rol fotoprotector Aunque los carotenoides cumplen un importante papel en la captación de energía lumínica, su papel como pigmentos fotoprotectores es crucial en la mantención de la función fotosintética en hábitats expuestos a altas intensidades lumínicas (Rau, 1988). Esta protección se atribuye a la capacidad de los carotenoides de apagar (“quench”) directamente el estado de triplete oxidado de la clorofila (3Chl), previniendo con esto la producción de singletes de oxígeno (1O2) o bien apagándolos (Thayer & Björkman, 1990; Asada, 1999; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001) y evitando así que el 1O2 estimule la formación de otras especies reactivas de oxígeno (ROS) tales como peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2 · -) y los radicales hidroxilo (HO · ) y perhidroxilo (O2H · ).Estas moléculas reactivas, especialmente OH · , son altamente destructoras de lípidos de membrana, ácidos nucleicos, y proteínas. Sin embargo, las especies de oxígeno reactivas como O2 · - y H2O2 son requeridas para algunos procesos vegetales como la lignificación y funcionan como señales en la respuesta defensiva contra la infección de patógenos (Buchanan et al., 2000). Se ha sugerido un rol específico de la zeaxantina, un carotenoide formado en el ciclo de las xantofilas, en la protección de los aparatos fotosintéticos contra los efectos adversos del exceso de luz (Demmig et al., 1987; Demmig-Adams & Adams, 1992; Bugos et al., 1998). Este ciclo (Fig. 2 y 3) convierte las tres xantofilas (carotenoides oxigenados), mediante secuencias de de-epoxidación por acción de la enzima violaxantina de-epoxidasa, desde el diepóxido violaxantina vía monoepóxido anteraxantina, a la forma de epóxido libre, zeaxantina, cuando la absorción de luz excede la utilización fotoquímica de ella. Esta interconversión ocurre en presencia de ascorbato y cuando la concentración de protones [H+] en el lumen tilacoidal alcanza un umbral crítico (lumen ácido), determinado por la bomba de protones inducida por luz (Gilmore & Yamamoto, 1992; Bugos et al., 1998; Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001; Elrad et al., 2002). La zeaxantina actuaría como “varilla de alumbrado” (lightning rod) recibiendo la energía de la misma forma que la clorofila y disipándola como calor, pudiendo esta energía ser medida por la emisión de fluorescencia (Demmig et al., 1987). En la oscuridad o cuando la luz no está en exceso se produce epoxidación (por acción de la enzima zeaxantina epoxidasa) de la zeaxantina a violaxantina vía el intermediario anteraxantina (Long & Humphries, 1994; Bugos et al., 1998; Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001). La reacción es óptima a un pH cercano a 7,5 y la enzima utiliza oxígeno, ferrodoxina y FAD como co-substratos (Bouvier et al., 1996; Bugos et al., 1998; Müller et al., 2001). Existen evidencias que apoyan la participación de los carotenoides en la mantención de una fotosíntesis adecuada ante condiciones de frío y alta intensidad lumínica, como ocurre en lugares ubicados en altura (Wildi & Lütz, 1996; Lütz, 1996). Especies de Lycopersicum provenientes de mayor altitud, sometidas a un tratamiento de enfriamiento responden con un incremento de carotenoides y un ajuste de su “pool” de xantofilas, conducente a presentar niveles mayores de zeaxantina que las de menor altitud (Venema et al., 1999). Mayores antecedentes sobre la capacidad de apagamiento de los carotenoides y su significado fisiológico se entregan mas adelante (punto 2.5). 2.3. Fluorescencia in vivo de la clorofila a en la medición del estado fisiológico del aparato fotosintético Cuando la energía lumínica es absorbida por una molécula de clorofila, se altera temporalmente su configuración electrónica (estado excitado) emitiendo fluorescencia. Este estado es inestable y de corta duración (<10-8 segundos), pues muchos procesos compiten para disipar la energía. Por lo tanto, in vivo, la clorofila presenta cambios en el rendimiento fluorescente durante la exposición a la luz (Kautsky & Hirsch, 1931). Estos cambios se deben a quela clorofila forma parte de complejos proteínas-pigmentos los cuales están embebidos en la membrana tilacoidal, y transmiten la excitación energética a los centros de reacción de los fotosistemas II (P680) y fotosistema I (P700) donde se produce la conversión energética por separación de cargas. FIGURA 2. Vía biosintética de carotenoides en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y plantas. Tomado de Niyogi et al., (1997). FIGURA 3. Vía biosintética del ciclo de las xantofilas a partir de β-caroteno en plantas superiores, con mención de las enzimas principales involucradas en la interconversión de estos pigmentos, extraído de Niyogi et al., (1998). Violaxantina de-epoxidasa es estimulada por un exceso de luz y pH ácido, mientras que zeaxantina epoxidasa se estimula con luz baja y pH neutro. A temperatura ambiente la fluorescencia variable (Fv) se origina casi exclusivamente del PSII, por lo que los cambios en fluorescencia reflejan primariamente el estado del PSII (Krause & Weise 1991). Esto no ocurre a temperaturas de -196ºC (77°K) donde se observa fluorescencia tanto del PSII (max em = 690 nm) como del PSI (max em = 730 nm) (Govindjee, 2002). Además, las variaciones en la distribución de la energía entre los dos fotosistemas también influyen en el rendimiento fluorescente. Como el PSI esencialmente no fluoresce, cualquier incremento en la transferencia de energía del PSII al PSI podría ser considerado como equivalente a la disipación no radiante (Björkman & Demmig, 1987). El estudio de la fluorescencia in vivo de la Chl a aporta información valiosa sobre el efecto que producen los diferentes tipos de estrés en la fotosíntesis. En los últimos años las técnicas de fluorescencia han sido aplicadas a estudios sobre la eficiencia fotoquímica o rendimiento cuántico máximo del PSII (ФPSII) (Demmig & Björkman, 1987; Krause, 1988; Planchon et al., 1989; Adams et al., 1990; Horton et al., 1994; Peterson & Aylor, 1995; Strasser et al., 1995,Strasser, 1997; Agati et al., 1996; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Estas técnicas se basan en inducir la emisión de fluorescencia de la Chl a en plantas adaptadas a la oscuridad y posteriormente iluminadas. Esta fluorescencia depende del estado de reducción de los aceptores primarios de electrones del PSII. La emisión de fluorescencia presenta una curva característica, denominada curva o efecto de Kautsky en honor a su descubridor (Kautsky, 1931), cuyos parámetros son utilizados en la interpretación del rendimiento cuántico del PSII (Krause & Weis, 1984; Krause, 1988; Strasser et al., 1995; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Para mejor comprensión de esta curva ver la (Fig. 4).De acuerdo a Kautsky, cuando una hoja es iluminada con una intensidad de luz constante, la emisión de fluorescencia también será constante. Sin embargo, si la hoja es mantenida en la oscuridad donde todos los componentes de la cadena transportadora de electrones se encuentran completamente oxidados, y es posteriormente irradiada con luz continua, la fluorescencia aumenta rápidamente a un nivel inicial bajo (Fo) fluorescencia inicial, característico de la apertura de los centros del PSII y la total oxidación del aceptor primario de electrones de este fotosistema QA. Posteriormente, la fluorescencia pasa por un nivel intermedio, a medida que la luz es absorbida y la separación de cargas tiene lugar, produciéndose el cierre de los centros y la reducción de QA, aumentando la fluorescencia hasta un nivel máximo (fluorescencia máxima, Fm), lo cual indica que QA se encuentra totalmente reducida. Al mantenerse la luz, los procesos fotosintéticos se activan, funcionando la cadena transportadora de electrones y la energía es usada en la reducción del CO2. Esto produce que la emisión de fluorescencia disminuya paulatinamente pasando por un segundo máximo (M), asociado con el inicio de la reducción del CO2 en el ciclo de Calvin (Ireland et al., 1984), hasta llegar a un nivel (T) cercano a Fo (Kautsky & Hirsch, 1931). La disminución de la fluorescencia más allá de su valor máximo hasta llegar a T responde a la activación de los procesos, relacionados con la transformación de la energía en el PSII y la cadena transportadora de electrones, coeficiente de “quenching” fotoquímico (qP) y el coeficiente de “quenching” no fotoquímico (qNP). Este último representa los procesos que disipan la energía como calor o como energía de transferencia. La fotoinhibición está relacionada con una disminución del rendimiento de la fluorescencia variable de la Chl a del PSII, lo que se manifiesta en una disminución del cuociente de fluorescencia variable y fluorescencia máxima, Fv/Fm (Ireland et al., 1984; Krause, 1988;Krause & Weis, 1984,1991; Ögren & Sjöström, 1990; Raggi, 1995; Raveh et al., 1995; Verhoeven et al., 1996, 1999; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000). En condiciones normales, la mayoría de las plantas superiores poseen un Fv/Fm óptimo cercano a 0,83 típico de plantas sanas, oscilando entre 0,7 a 0,85 (Krause, 1988; Krause & Weis, 1984, 1991; Björkman & Demmig, 1987; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Un descenso de Fv/Fm ha sido relacionado con una caída en el rendimiento fotónico óptimo de la fotosíntesis, mientras que la recuperación de este estado se asocia con un reestablecimiento de Fv/Fm (Adams et al., 1990). En plantas de cereales y pino sometidas a tratamiento frío, la fotoinhibición ocurre gradualmente alcanzando un estado de equilibrio cerca de las 20 y 60 horas de tratamiento frío, respectivamente, decreciendo Fv/Fm en un 20% en los cereales y un 60% en pino (Öquist & Huner, 1991). En plantas de espinaca no aclimatadas al frío, el Fv/Fm desciende en un 50% (desde 0,8 a 0,4) bajo un tratamiento frío (4°C) y alta luminosidad, mientras que plantas aclimatadas al frío presentaron un valor de 0,7. La caída fotoinhibitoria de Fv/Fm se caracteriza por un incremento en Fo y disminución de Fv (Somersalo & Krause, 1989). En plantas de cebada fotoinhibidas, este proceso puede ser rápidamente revertido y disminuir al cambiar las plantas a temperaturas óptimas de crecimiento, lo que se expresa en un aumento de Fv/Fm (Greer et al., 1991). El descenso de la tasa fotoquímica del PSII, se expresa como un incremento en Fo (probable alteración del centro de reacción) y un aumento de la tasa de disipación no radiativa de la energía de excitación, como un decrecimiento en Fo y Fm (Demmig et al., 1987; Demmig & Adams, 1992). Cabe señalar que ambos procesos son observados como una disminución en Fv/Fm, aún cuando las características en la intensidad de la fluorescencia en los centros de reacción abiertos y cerrados puedan ser diferentes (Long et al., 1994). La función indicadora de la actividad fotosintética que se atribuye a la fluorescencia de la clorofila a proviene del hecho que la emisión de fluorescencia es complementaria al resto de las vías de desexcitación (traslado de la energía fotónica) del PSII, fundamentalmente en la forma fotoquímica y la de disipación de calor. Así, la eficiencia en la emisión de fluorescencia es mayor cuanto menor es la eficiencia de los mecanismos de disipación fotoquímicos y en forma de calor. Teniendo en cuenta que la fluorescencia de la clorofila se origina principalmente en el PSII, y que más del 90% de la emisión de fluorescencia se origina en la clorofila a de este fotosistema, la transferencia de la energía de excitación al PSI debe ser considerada como una vía adicional y competitiva de desexcitación. Por lo tanto, la fluorescencia de la clorofila a del PSII podría funcionar como indicador de todos los niveles funcionales de la fotosíntesis y reacciones fotosintéticas de las plantas verdes. Un gran número de estudios así lo han demostrado desde que Kautsky & Hirsch (1931) descubrieron que esta emisión presenta cambios característicos cuando una planta es sometida a iluminación luego de estar en la oscuridad (Krause & Weis, 1984). 2.4. Mecanismos de desexitación de la clorofila a del PSII Desde el punto de vista de la emisión de fluorescencia existen fundamentalmente dos mecanismos que compiten durante los procesos de desexcitación. Estos son la conversión fotoquímica de energía en los centros de reacción del PSII y los mecanismos no fotoquímicos al nivel de antena y centros de reacción (Horton, et al., 1996) (Fig. 5). Debido a la intervención de ambos mecanismos la eficiencia potencial de emisión de fluorescencia resulta disminuida definiéndose dos mecanismos de amortiguamiento o apagamiento “quenching” fotoquímico (utilización de electrones en la cadena fotosintética) y no fotoquímico (disipación de la energía en forma de calor). La correcta interpretación de los cambios en la emisión de fluorescencia requiere conocer la contribución relativa de estos mecanismos de amortiguamiento. Recientemente se ha desarrollado una técnica no intrusiva (Fig. 5) para determinar in vivo la fluorescencia de la clorofila a del PSII, que utilizando luz actínica modulada de baja intensidad y pulsos de luz de mayor intensidad permite evaluar a través de la obtención de fluorescencias máximas y variables, no sólo los rendimientos cuánticos óptimos (en plantas adaptadas a la oscuridad) sino también las fluorescencias efectivas, Fm’ y Fv’ (Fm’- Fo’) (en plantas adaptadas a la luz), y la distribución de la energía, es decir cuanta energía se transfiere a la cadena transportadora de electrones fotosintética (quenching o apagamiento fotoquímico: qP) y aquella disipada en forma de calor (quenching o apagamiento no fotoquímico: qNP) (Schreiber et al.,1986). 2.5. Bases moleculares de los mecanismos de apagamiento (quenchings) y su asociación con los carotenoides del ciclo de las xantofilas Aunque las bases moleculares de los mecanismos de apagamiento aun se desconocen, se pueden hacer algunas consideraciones (Büchel & Wilhelm, 1993): El qP depende estrictamente del estado de oxidación del primer aceptor del PSII la QA, e indica la eficiencia fotoquímica de los fotones capturados por los centros de reacción. Sin embargo, el qP es presumiblemente mayor que el porcentaje de QA oxidados, debido a la migración de energía de centros cerrados a abiertos. Adicionalmente, QA oxidado puede actuar de “apagador” o “quencher”. Por ende, el verdadero valor de Fm se alcanza sólo cuando todo el “pool” de plastoquinonas (PQ) está reducido. FIGURA 4. Efecto Kautsky. Curvas de emisión de fluorescencia de hojas previamente adaptadas a la oscuridad. Estas muestran que la emisión de fluorescencia varía en función del tiempo de manera bastante compleja. En el momento de la iluminación, la fluorescencia aumenta casi instantáneamente hasta un nivel inicial (Fo) luego aumenta rápidamente hasta un nivel máximo (Fm). Finalmente la emisión de fluorescencia disminuye lentamente hasta un estado estacionario (T), después de haber pasado por un segundo máximo (M). Los cambios de la intensidad de la fluorescencia observados durante la transición obscuridad/luz son función de la activación de los procesos fotosintéticos FIGURA 5. Cinética de emisión de fluorescencia obtenida con el fluorímetro de pulso de amplitud modulada FMS 1 (Hansatech, Reino Unido). Las flechas negras indican el encendido de la luz de medida. Las flechas negras quebradas indican los pulsos de saturación. Con las flechas rojas se indica el encendido y apagado de la luz actínica, y la flecha de color lila un pulso de rojo lejano, modificado de Ulloa (2002). El significado de los parámetros de fluorescencia (símbolos) se indican en las páginas 28 y 29. El qNP puede estar compuesto de varios mecanismos de apagamiento independientes, siendo importante el apagamiento o “quenching” energético (qE), que contribuye a la mayor parte del qNP. El qE está determinado por la acumulación de protones en el lumen tilacoidal, movilizados por el flujo fotónico, de modo que el qNP se asocia con el incremento del pH intratilacoidal y con la presencia de zeaxantina, cuando hay un exceso de luz (Bilger & Björkman, 1990; Müller et al., 20001; Elrad et al., 2002). La zeaxantina actúa como apagador. Se asume que esta acción se produciría por: (1) apagamiento directo del singlete excitado de la clorofila, por transferencia de energía desde la clorofila a la zeaxantina, lo que requiere proximidad física entre ambas moléculas (Ruban et al., 1993) y (2) por alteración de las propiedades de la membrana tilacoidal, por parte de este pigmento, al promover la agregación de los principales complejos recolectores de luz o por cambio en la fluidez de la membrana tilacoidal, disminuyendo la fluidez, incrementando la termoestabilidad y reduciendo la susceptibilidad a la peroxidación lipídica, al interaccionar las xantofilas y los lípidos de membrana (Havaux, 1998; Havaux & Niyogi, 1999). En este caso la zeaxantina actuaría como amplificador del apagamiento más que como apagador directo (Thiele & Krause, 1994; Thiele et al., 1998). Deschampsia antarctica y Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl., son las únicas plantas vasculares que han colonizado en forma natural la Antártida (Alberdi et al., 2002). Pueden mantener un 30 a 40% de sus tasas fotosintéticas máximas a 0°C, siendo la temperatura óptima para este proceso de 13 y 19°C, respectivamente (Edwards & Smith, 1988). Estos autores señalan, que en la mayoría de las especies de gramíneas septentrionales o australes (subpolares), una fotosíntesis neta significativa, se produce en un rango de temperaturas entre 0 y -5°C. En ambientes de bajas temperaturas, otro factor que puede también contribuir a limitar la fotosíntesis es la intensidad lumínica, lo que puede conducir a fotoinhibición (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Schöner & Krause, 1990; Mishra et al., 1993). La temperatura óptima para la fotosíntesis exhibida por una especie vegetal refleja el rango de temperaturas ambientales en las cuales las especies crecen en su ambiente natural (Berry & Björkman, 1980; Sakai & Larcher, 1987; Larcher, 1995). La mayoría de los estudios en relación con el efecto de las bajas temperaturas sobre la fotosíntesis se refieren a plantas de altura o cultivadas. Pocos estudios referentes a este tema se han realizado en plantas vasculares capaces de colonizar la región Antártica (Edwards & Smith,1988; Xiong et al., 1999). Mayores antecedentes bibliográficos al respecto en Alberdi et al. (2002). En el presente estudio, y mediante el uso de diferentes parámetros de fluorescencia, se pretende evaluar los cambios en la eficiencia fotoquímica primaria del PSII, que pudieran dar cuenta de daños fotoinhibitorios en D. antartica,sometida al efecto simultáneo de frío e intensidad lumínica y su posible asociación con el ciclo de las xantofilas. Adicionalmente, se pretende estudiar el efecto que posee una aclimatación previa al frío sobre los parámetros anteriores. 2.6. Hipotesis Teniendo en cuenta las condiciones climáticas (alta luminosidad y bajas temperaturas) bajo las cuales D. antarctica crece y fotosintetiza durante el verano antártico, y a las cuales debería estar adaptada, se formula la hipótesis siguiente: D. antarctica debiera mantener una alta eficiencia fotoquímica (no fotoinhibirse) del PSII, aún cuando interactúen simultáneamente bajas temperaturas y altas intensidades de flujo fotónico. El aumento de carotenoides, disipadores de energía, específicamente zeaxantina, en respuesta a condiciones de alto flujo fotónico y baja temperatura, sería el mecanismo que evita el daño fotoinhibitorio en esta especie. 2.7. Objetivos generales Estudiar los cambios en la eficiencia fotoquímica del PSII en plantas no aclimatadas y aclimatadas al frío de D. antarctica, sometidas al efecto simultáneo del frío y altas intensidades lumínicas, por tiempo variable y establecer los cambios de concentración de pigmentos fotoprotectores (carotenoides), que pudiesen asociarse a estas condiciones. 2.8. Objetivos especificos En plantas de D. antarctica no aclimatadas y aclimatadas al frío y sometidas al efecto simultáneo del frío y diferentes niveles de intensidad lumínica, por tiempo variable, se determinarán los siguientes objetivos específicos: a) Evidenciar los cambios que experimentan los diversos parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII. b) Establecer los cambios en contenido hídrico foliar. c) Determinar la concentración de pigmentos (clorofila a, b). d) Determinar los cambios en los contenidos de carotenoides totales y de los pigmentos del ciclo de las xantofilas (zeaxantina, anteraxantina, violaxantina).