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Título:
Estudio de la interacción de la proteína quinasa spak con el canal de cloruro gpCLC-2
Autor:
Maturana Fourniel, Carola Jeannette
Profesor Patrocinante:
Cid S., Pablo; Reyes Pinto, Alejandro Mauricio
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
proteínas quinasas; canal de cloruro; mutación
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2007
Resumen:
El canal ClC-2 pertenece a la familia de transportadores y canales de cloruro ClC. Se expresa en diversos tejidos, pero su papel fisiológico aún es materia de estudio. En el colon, se expresa en la superficie celular y se postula que participa en la absorción de electrolitos y fluidos. Existe una variante de empalme (splicing), carente de diez aminoácidos en el extremo amino terminal, que origina un canal con cinética de cierre rápida. En esta región existe un motivo de consenso de unión a la proteína quinasa SPAK (Ste20-related proline alanine-rich kinase). Esta proteína quinasa modula proteínas relacionadas con el transporte transepitelial de NaCl. Estudios electrofisiológicos de mutaciones en el motivo de unión obtenidos en nuestro laboratorio sugieren que la cinética de cierre del canal es influida por la interacción del canal con SPAK. Con el objetivo de evaluar dicha interacción se realizaron ensayos de co-inmunoprecipitación y FRET. Estos experimentos no discriminaron entre la variante de empalme y el canal completo. El análisis de las secuencias de la EGFP y sus variantes utilizadas en este trabajo demostraron la presencia de un supuesto motivo de unión a SPAK que explicaría los resultados. Alternativamente realizamos ensayos de co-inmunoprecipitación, utilizando el epítopo V5 fusionado al carboxilo terminal del canal, pero no logramos demostrar interacción de proteínas. Estos resultados podrían ser falsos negativos debido a la falta de estandarización de las condiciones de ensayo con el nuevo anticuerpo o que la interacción entre las proteínas es débil. Como alternativa a que la interacción no exista, los efectos funcionales observados podrían ser explicados por cambios conformacionales del segmento amino terminal de la proteína, secundario a las mutaciones.
Abstract:
ClC-2 is a member of the ClC family of chloride transporter and channels. It is expressed in different tissues, but its physiological role is still subject of study. In colon, is expressed in the surface of the cells, and it is postulated that is involved in the electrolytes and fluids absorption. There is an alternative splicing, which lack of ten amino acids at the amino terminal of the protein, which render a channel with faster closing kinetic. In this amino acid region there is a consensus motive that can bind SPAK protein kinase (Ste20-related proline alanine-rich kinase). This kinase protein modulates NaCl transepitelial transport-related proteins. Previous electrophysiological studies of mutants in the binding motive studies in our laboratory suggest that the closing kinetics channel is influenced by the SPAK interaction with the channel. In order to characterize the interactions, co-inmunoprecipitación and FRET assays were performed. These experiments demonstrated interaction with the kinase but it could not distinguish between both splicing variants of the full channel. The sequences analysis of the EGFP and its variants used in this work demostrated the presence of a putative SPAK binding motive explaining the results. Alternatively we perform co-inmunoprecipitación assays, using a V5 epitope attach to the carboxy terminal of the channel and we did not find protein interaction. These results could be false negative due to a lack of standardization of assay conditions with the new antibody or that the interaction between the proteins is weak. Alternatively the interaction does not exist and the functional effects observed are explained by conformation change in the of amino-terminal segment of the protein secondary to the mutations.
Palabras Clave:
proteínas quinasas; canal de cloruro; mutación
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Maturana Fourniel, Carola Jeannette
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2007/fcm445e/doc/fcm445e.pdf