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Título:
Montaje de un sistema de caracterización molecular para genotipificación de deficiencia de adhesión leucocitaria bovina (BLAD) y de deficiencia de argininosuccinato sintetasa bovina (Citrulinemia bovina)
Autor:
Sepúlveda Muñoz, Héctor Patricio
Profesor Patrocinante:
Figueroa Valverde, Jaime Eugenio
Grado a Optar:
Químico Farmacéutico - Licenciado en Ciencias Farmacéuticas
Materia:
patología veterinaria; enfermedades genéticas - veterinaria
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Química y Farmacia
Año de Aceptación:
2006
Resumen:
La deficiencia de adhesión leucocitaria bovina (BLAD) y la deficiencia de argininosuccinato sintetasa bovina (Citrulinemia Bovina) son enfermedades autosómicas recesivas y son letales en ganado Holstein Friesian afectados. BLAD se caracteriza por una mutación en el gen CD18 causando que los leucocitos no migren fuera de los vasos sanguíneos hacia los sitios de la infección. Por otra parte, Citrulinemia bovina es caracterizada por una hiperamonemia debido a una deficiencia de la enzima del ciclo de la urea, la argininosuccinato sintetasa. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un análisis confiable para diagnosticar estas enfermedades genéticas. La metodología descrita está basada específicamente en PCR seguido por RFLP. Este método fue diseñado para ser usado por el centro de inseminación artificial de la UACh para la genotipificación de su ganado y para ser ofrecido como producto de servicio para el resto del país. Para la determinación de BLAD dos pares de partidores fueron usados probando así dos métodos diferentes a otros usados en anteriores publicaciones. La extracción de DNA genómico desde muestras de sangre, pelo y semen fue realizada utilizando Chelex-100 al 5%. Los resultados fueron validados por comparación con aquellos obtenidos usando la técnica tradicional de extracción de DNA de fenol/cloroformo. Para la identificación de Citrulinemia y BLAD se usó una reacción de PCR seguido por análisis con las enzimas de restricción AvaII y TaqI, respectivamente. Los fragmentos de restricción resultantes fueron visualizados en geles de agarosa y poliacrilamida, nativos y en gradiente. Los resultados aquí obtenidos identificaron en forma rápida e inequívoca a los individuos homocigotos sanos para ambas enfermedades.
Abstract:
The bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) and the bovine argininosuccinate synthetase deficiency (Bovine Citrullinemia) are both autosomal recessive lethal diseases that affect Holstein Friesian cattle. BLAD is characterized by mutations in the CD18 gene that cause leukocytes to be unable to travel outside blood vessels towards sites of infection. On the other hand, Bovine Citrullinemia is characterized by hyperammonemia due to deficiency of the urea cycle enzyme, argininosuccinate synthetase. The objective of this work was to develop a reliable assay to diagnose these genetic diseases. The methodology described here is based on a specific polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. This method was intended to be used by the “Centro de Inseminacion Artificial” of the Universidad Austral de Chile (UACh) for the genotyping of their cattle and to be offered as a service product to the rest of the country. For the determination of BLAD two pairs of primers were used. Thus, we designed two different methods from the ones used by other publications. The extraction of bovine genomic DNA from blood samples, hair and semen was made with Chelex-100 used at 5%. These results were compared with more traditional techniques like phenol/chloroform DNA extraction to validate the data. PCR based DNA amplification followed by analysis with the restriction enzymes AvaII and TaqI were used for the identification of Citrullinemia and BLAD respectively. The resulting restriction fragments were visualized in regular agarose and non-denaturing polyacrilamide gels in gradient. Genotypification of BLAD and Bovine Citrullinemia by the method described here rapidly and unequivocally identifies normal individuals from those with the disease.
Palabras Clave:
patología veterinaria; enfermedades genéticas - veterinaria
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Sepúlveda Muñoz, Héctor Patricio
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2006/fcs479m/doc/fcs479m.pdf