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Título:
Análisis funcional de las mutantes G111A y G116A en el transportador de hexosas Glut1
Autor:
Raddatz Cárdenas, Natalia Alejandra
Profesor Patrocinante:
Reyes Pinto, Alejandro Mauricio
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
transporte biológico; proteínas transportadoras; glucosa
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2006
Resumen:
El transportador de glucosa, GLUT1, presenta tres secuencias aminoacídicas cortas (dominios I, II y III) que presentan similitud de secuencias con sitios de unión a nucleótidos como ATP. Sin embargo, este transportador es del tipo facilitativo, por lo que no requiere del aporte de energía de la hidrólisis de ATP para realizar su función. Para reconocer la importancia funcional de estos dominios nos propusimos estudiar específicamente el dominio I a través del análisis de dos mutaciones puntuales de los aminoácidos Gly111 y Gly116, ambas por Ala. Se llevó a cabo un análisis cinético detallado de la proteína silvestre y de las mutantes en un sistema de expresión en ovocitos de Xenopus laevis, en condiciones trans-cero de entrada y de intercambio en equilibrio. Asimismo, se estudió la regulación del transportador por ciertas flavonas y tirfostinas, por lo cual analizamos el efecto de tirfostina A47 (compuesto que se une a un sitio accesible por la cara endofacial) y quercetina (que se une a la cara exofacial de la proteína) tanto en condiciones trans-cero de entrada como de intercambio en equilibrio. Nuestros resultados muestran que las mutantes se expresan eficientemente en este sistema de expresión y que ambas son funcionales. Sus propiedades de eficiencia catalítica y de afinidad por sustrato no difieren de manera notable de aquellas de la proteína silvestre. Asimismo, la interacción con tirfostina A47 no se afecta en las mutantes, en cambio, la mutante G116A no es sensible a la flavona quercetina en condiciones trans-cero de entrada. Estos resultados nos indican que G116A podría formar parte de un sitio de unión alostérico para flavona, el cual al parecer es accesible por la superficie exofacial de la proteína.
Abstract:
The glucose carrier, GLUT1, has three short amino acid sequences (domains I, II and III), that shows sequence homology with binding sites for nucleotides, such as ATP. However this carrier is of facilitative type, so it does not require energy from ATP hydrolysis to accomplish its function. To recognize the functional importance of these domains we focus on domain I, through the analysis of two point-mutations of the amino acids Gly111 and Gly116, both mutated by Ala. We make a detailed kinetic analysis of the wild protein and mutants in Xenopus laevis oocytes expression system, in trans-zero uptake and equilibrium exchange conditions. Likewise, the regulation of the transporter by some flavones and tyrphostin was studied. We analyze the effect of Tyrphostin A47 (compound that binds to the endofacial face) and quercetin (flavone that binds to the exofacial face of the protein) both in trans-zero uptake and equilibrium exchange conditions. Our results shows that the mutants are efficiently expressed on this expression system and both are functional. Their properties of catalytic efficiency and substrate affinity do not differ on a notable way of those of the wild type protein. Moreover, the interaction with Tyrphostin A47 was not affected on the mutants, in contrast mutant G116A is insensitive to the flavone quercetin, under trans-zero uptake conditions. These results indicate us that G116 could be part of an allosteric binding site for flavones, wich seems to be accessible by the exofacial surface of the protein.
Palabras Clave:
transporte biológico; proteínas transportadoras; glucosa
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Raddatz Cárdenas, Natalia Alejandra
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2006/fcr125a/doc/fcr125a.pdf