Información detallada Tesis (Metadatos y Resúmenes)

Título:
Clonamiento y localización subcelular de la isofroma hepática de rata de 6-fosfofructo-2-Quinasa/Fructosa-2, 6-Bifosfatasa
Autor:
Velásquez Boulet, Zahady Dafnée
Profesor Patrocinante:
Yañez Cárcamo, Alejandro Javier
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
enzimas; función hepática; clonación
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2005
Resumen:
Las vías glicolíticas y gluconeogénicas son reguladas por hormonas y por metabolitos de bajo peso molecular, como fructosa-2,6-bisfosfato, el cual es un activador alostérico de la enzima glicolítica 6-fosfofructo-1-quinasa, y un potente inhibidor de la enzima gluconeogénica fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa). Este metabolito es sintetizado y degradado por la acción de la enzima bifuncional 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa. Otro mecanismo propuesto para la regulación de las vías metabólicas es la compartimentación de estas a nivel subcelular. En la actualidad no existen datos acerca de la localización de 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa (PFKFBPasa2) y posibles cambios en la localización, moduladas por el estado metabólico. En base a estos antecedentes, propusimos determinar la localización subcelular de PFKFBPasa2 en distintas condiciones metabólicas. Para ello, utilizando partidores específicos para PFKFBPasa2 se clonó la isoforma hepática de rata en el vector pEGFP-C1. Mediante la fluorescencia de EGFP, pudimos determinar la distribución subcelular de esta proteína de fusión en líneas celulares de hígado, riñón y carcinoma. Previamente, se determinó mediante western blot la presencia de las isoformas hepáticas de FBPasa y PFKFBPasa2 en todas las líneas celulares estudiadas. Utilizando microscopía confocal, se observó, en las líneas HepG2 y EBNA, una movilización de la enzima PFKFBPasa2 desde el núcleo al citoplasma en presencia de glucosa. Al contrario, en la línea hepática FTO2b, la translocación es desde el citoplasma al núcleo en iguales condiciones. Por otro lado, FBPasa y PFKFBPasa2, en todas las líneas estudiadas, co-localizaron en el citoplasma de la célula, lo que nos permite concluir que la función de PFKFBPasa2 en el núcleo es independiente de la presencia de FBPasa.
Abstract:
The glycolityc and gluconeogic pathways are regulated by hormones and metabolites of low molecular weight, like fructose-2,6-bisphosphate, which is the principal inhibitor of the gluconeogenic enzyme fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase). Fruc-2,6-P2 is synthesized and degradated by the action of the bi-functional enzyme, 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFBPase2). Another mechanism proposed to regulated these pathway, is its compartmentation at subcellular level. Nevertheless, there is no information about the modulation of PFKFBPase2 and the possible changes of localization in response to metabolic state. Thus, we proposed to study the expression and subcellular localization of PFKFBPase2 in diverse cell lines under different metabolic conditions. For that, we used specific primers for PFKFBPase2 to clone the rat liver isoform, in the pEGFP-C1 vector. Through fluorescence of EGFP, we determined the subcellular localization of the fusion protein in the liver, kidney and carcinome cell lines. Previously, we determinated, by western blot assay, the localization of the hepatic isoforms of FBPase and PFKFBPase2 in the studied cell lines. Using confocal microcopy we observed the translocation of PFKFBPase2 from the nuclei to the cytoplasm in the presence of glucose in the cell lines HepG2 and EBNA On the contrary, in the hepatome cell line FTO2b, the translocation is from the cytoplasm to the nuclei in the same conditions. The results show that both PFKFBPase2 and FBPase in all lines studied co-localized in cell cytoplasm. This allows us to conclude that the PFKFBPase2 functions in the nuclei is independent of the presence of FBPase.
Palabras Clave:
enzimas; función hepática; clonación
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Velásquez Boulet, Zahady Dafnée
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2005/fcv434c/doc/fcv434c.pdf