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Título:
Identificación de los eventos moleculares que determinan la irreversibilidad en la muerte celular necrótica inducida por estrés oxidativo
Autor:
Ruminot Moraga, Iván Marcelo
Profesor Patrocinante:
Barros O., Felipe
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
estrés oxidativo; muerte celular; necrosis
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2005
Resumen:
La muerte celular necrótica depende de la acumulación intracelular de iones Ca2+ y Na+, sin embargo, aún se desconocen los mecanismos que llevan al desbalance iónico. En este trabajo se investigaron parámetros asociados a la necrosis con el fin de descubrir el (los) determinante (s) de la irreversibilidad en la muerte celular necrótica inducida por estrés oxidativo. Células epiteliales Clone 9 fueron expuestas por tiempos crecientes a H2O2 (32 mM), necesitándose 14±2 minutos (n=36) para inducir un 50% de necrosis. Este tiempo fue entonces definido operacionalmente como el punto de no retorno (PNR). Usando sondas fluorescentes y microscopía confocal se observó que el PNR coincide con la depolarización mitocondrial y el inicio de la sobrecarga de cationes. La remoción del peróxido antes del PNR, normalizó los parámetros funcionales, sin evidencia de necrosis evaluada a las 20 horas. Contra lo esperado, estas células sub-necróticas tampoco presentaron apoptosis, a juzgar por actividad de caspasas, fragmentación del DNA y morfología nuclear. Luego se evaluó el posible papel de la mitocondria en la irreversibilidad necrótica. Los inhibidores metabólicos mitocondriales FCCP (2 μM) y rotenona (2 μM) adelantaron significativamente el punto de no retorno a 1,8±0,4 minutos (n=5) y 5,0±1,3 minutos (n=3), respectivamente. Por el contrario, el bloqueador del poro de transición mitocondrial ciclosporina A (100 μM), retardó el punto de no retorno a 23,1±6 minutos (n=3). Experimentos suplementarios en células HeLa mostraron que la sobrecarga necrótica de calcio inducida por estrés oxidativo fue dependiente del consumo de ATP por la bomba de Na+/K+ ATPasa. La inhibición farmacológica y funcional de la bomba revirtió la sobrecarga tardía de calcio, además de proteger significativamente la necrosis. En su conjunto estos resultados establecen al poro de transición mitocondrial y a la bomba de Na+/K+ ATPasa como elementos claves en la muerte necrótica inducida por peróxido de hidrogeno en células epiteliales.
Abstract:
The necrotic cell death depends on the intracellular accumulation of Ca+2 and Na+, however, the mechanisms that produce the ionic desbalance are unknown. In this work were investigated parameters associated to the necrosis with the purpose of discovering determinants of the irreversibility in the necrotic cell death induced by oxidative stress. Clone 9 ephitelial cells were exposed per increasing times to H2O2 (32 mM), and required 14±2 minutes (n=36) to induce a 50% of necrosis. This time was defined operationally as the point of no return (PNR). Using fluorescent dyes and confocal microscopy it was observed that the PNR agrees with the mitochondrial depolarization and the beginning of the cation overload. The removal of peroxide before the PNR, normalized the functional parameters, without evidence of necrosis evaluated at 20 hours. Surprisingly, these sub-necrotic cells did not present apoptosis either, judging by activity of caspases, DNA fragmentation and nuclear morphology. After this, the possible role of the mitochondria in the necrotic irreversibility was evaluated. Mitochondrials poisons FCCP (2 mm) and rotenone (2 mm) significantly advanced the point of no return to 1,8±0,4 minutes (n=5) and 5,0±1,3 minutes (n=3), respectively. On the other hand, the blockade of the pore of mitochondrial transition with cyclosporin A (100 mM) retarded the point of no return to 23,1 ± 6 minutes (n=3). Additional experiments in HeLa cells showed that the necrotic calcium overload induced by oxidative stress was employeed in the consumption of ATP by the Na+/K+ ATPase.The farmacological and functional inhibition of the pump reverted the delayed calcium overload and also protected the necrosis significantly. In conclusion, these results establish that the pore of mitochindrial transition and the Na+/K+ ATPase are key elements in the necrotic death induced by hydrogen peroxide in epithelial cells.
Palabras Clave:
estrés oxidativo; muerte celular; necrosis
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Ruminot Moraga, Iván Marcelo
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2005/fcr936i/doc/fcr936i.pdf