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Título:
Obtención y caracterización de la mutante sitio específica Phe16Trp de la fructosa-1,6-bisfosfatasa de riñón de cerdo
Autor:
Maureira Navarrete, Marco Antonio
Profesor Patrocinante:
Yañez Cárcamo, Alejandro Javier
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
mutagénesis; fructosa-1,6-bisfosfatasa; enzimas; riñón; porcinos
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2005
Resumen:
La enzima fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) de riñón de cerdo cataliza una reacción esencial para la gluconeogénesis, la hidrólisis de fructosa-1,6-bisfosfato (Fru-1,6-P2) a fructosa-6-fosfato (Fru-6-P) más fosfato inorgánico. Es un homotetrámero cuya actividad catalítica es regulada por el inhibidor alostérico AMP y por el inhibidor competitivo fructosa-2,6-bisfosfato. La enzima requiere de la presencia de cationes metálicos divalentes (Mg^2+ o Mn^2+) para su actividad. Estudios de difracción de rayos-X de los cristales de la FBPasa de riñón de cerdo han determinado la existencia de dos interfases diferentes, en las cuales los sitios de unión alostérico para el inhibidor AMP se encuentran ubicados en la interfase C1-C4 y C2-C3. Para estudiar los cambios conformacionales producidos por la unión de AMP y la transmisión cooperativa entre la subunidad C1-C4, se introdujo por mutagénesis sitio dirigida una sonda fluorescente de triptófano en el residuo fenilalanina en posición 16 en esta interfase. La mutante que posee un único residuo de triptófano Phe16Trp fue expresada en E. Coli, utilizando el sistema de expresión pET 15b, y purificada a homogeneidad. Estudios cinéticos demuestran que la enzima mostró tener parámetros similares a la FBPasa silvestre. El mutante no mostró cambios en la afinidad por el nucleótido. Sin embargo, se determinó que la FBPasa mutante Phe16Trp perdió completamente la cooperatividad para la unión del inhibidor alostérico AMP. Además, se observa una curva bifásica en la inhibición por AMP, sugiriendo que el nucleótido se une a sitios de la enzima con diferentes afinidades. Por otra parte, la mutante exhibe un máximo de emisión de fluorescencia a 337 nm y esta emisión es perturbada, principalmente, por la adición del inhibidor alostérico AMP. Estos resultados demuestran la utilidad de esta mutante para sensar cambios conformacionales que afectan a la interfase C1-C4 o C2-C3.
Abstract:
Pig kidney fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) catalyzes an essential reaction in gluconeogenesis, the hydrolysis of fructose-1,6-bisphosphate (Fru-1,6-P2) to fructose-6-fosphate (Fru-6-P) and inorganic phosphate. FBPasa is a homotetramer which is regulated by the allosteric inhibitor AMP and by the competitive inhibitor fructose-2,6-bisphosphate. The enzyme requires the presence of divalent metal ions (Mg^2+ o Mn^2+) for its activity. Crystals diffraction studies of ray-X of the pig kidney FBPasa have determined the existence of two different interfaces, where the binding site for the inhibitor AMP is located in the interface C1-C4 and C2-C3. In order to study the conformational changes yielded for the binding of AMP and the cooperative transmission between the subunidad C1-C4 or C2-C3, A fluorescent probe of tryptophan was introduced by site-directed mutagénesis replacing the residue phenilalanine in position 16 at this interface. The mutant enzyme Phe16Trp was expressed in E. Coli using the expression system pET 15b and purified to homogeneity. Kinetic studies shown that the Phe16Trp mutant have similar kinetic parameters than the wild type FBPase. This mutant didn`t have changes in the affinity for the nucleotide. However, the mutant Phe16Trp also shown the complete lost of the cooperativity for the binding of the alosteric inhibitor AMP. Also, a two-phase curve is observed in the inhibition by AMP, that which can be interpreted by the binding from the nucleótide to class of binding sites in the enzyme with different affinity. On the other hand, the enzyme mutant exhibits a maximum of emission of fluorescence to 337 nm and this emission is perturbed mainly by the addition of the inhibitor alosterico AMP. These results demonstrate the utility of this mutant for sensar conformational changes that affect to the interface C1-C4 or C2-C3.
Palabras Clave:
mutagénesis; fructosa-1,6-bisfosfatasa; enzimas; riñón; porcinos
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Maureira Navarrete, Marco Antonio
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2005/fcm477o/doc/fcm477o.pdf