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Título:
Importancia de las cisteínas 238 y 295 en las interacciones entre las subunidades en el dímero y en tetrámero de la fosfofructoquinasa-2 de E. coli
Autor:
Caniuguir Ortega, Andrés Nilson
Profesor Patrocinante:
Guixé L., Victoria
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
fosfofructoquinasa-2; Escherichia coli; enzimas
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2005
Resumen:
La unión de MgATP a un sitio alostérico en la enzima homodimérica fosfofructoquinasa-2 (Pfk-2) de E. coli, conduce a la inhibición de la actividad enzimática y a la formación de tetrámeros. La modificación química con pireno maleimida del residuo Cys-238 produce una enzima monomérica que es activa pero se comporta como dímero en presencia de los sustratos. Por otra parte, la modificación de Cys-295 con eosina maleimida genera una enzima dimérica, inactiva e incapaz de tetramerizar. Estos resultados sugieren que Cys-238 es un determinante de la estructura dimérica y que Cys-295, tiene un rol catalítico y en la formación de tetrámeros. Con el objetivo de evaluar la importancia de estos aminoácidos en la estructura y la función de Pfk-2 se estudiaron los efectos del cambio de estas cisteínas por alanina (Ala) y fenilalanina (Phe) sobre los parámetros cinéticos, la unión de ligandos, la estabilidad del dímero y la estabilidad del tetrámero de Pfk-2. Además, se correlacionaron estos efectos con la localización de estas cisteínas en el modelo molecular del dímero y del tetrámero de la enzima. Los parámetros cinéticos de las enzimas mutantes de Cys-238 no fueron significativamente diferentes a los de la enzima silvestre, mientras que la mutación de Cys-295 por Ala o Phe produjo una disminución de 2 a 7 veces en la kcat y un incremento de entre 3 y 6 veces en las Km para ambos sustratos. Experimentos de desnaturación por cloruro de guanidinio y del efecto de la concentración de proteína sobre la actvidad enzimática muestran una estrecha correlación entre la pérdida de la actividad y la disociación del dímero en Pfk-2 silvestre. Las mutantes de Cys-238 (por Ala y Phe) presentan un comportamiento similar al de la enzima nativa, en tanto que la mutante de Cys-295-Phe es menos estable a la desnaturación y más sensible a la dilución de la proteína. Estos resultados sugieren que la mantención de la estructura dimérica es esencial para la actividad enzimática y que el residuo Cys-238 no contribuye ni a la interacción monómero-monómero, ni a la estabilidad del dímero. Todas las mutantes de Cys-238 y Cys-295 son inhibidas alostéricamente por MgATP como la enzima nativa, pero sólo la mutante Cys-295-Phe requiere concentraciones mayores que 5 mM de fructosa-6-P para revertir la inhibición. Este efecto está correlacionado con un incremento en la estabilidad del tetrámero de esta mutante, ya que la concentración de cloruro de guanidinio necesaria para desplegar la enzima en presencia de 1 mM MgATP es mayor que para el resto de las mutantes y la enzima silvestre. Además, ambas mutantes de Cys-295 presentan un leve incremento en la Kd para la unión de fructosa-6-P, en concordancia con el incremento observado en la Km para el azúcar-fosfato. Los resultados obtenidos son consistentes con la ubicación del residuo de Cys-295 en el modelo por homología del tetrámero de Pfk-2, el que se ubica en una región muy cercana del sitio activo y de la interface dímero-dímero. Por lo tanto, es probable que su modificación afecte las propiedades del sitio activo y la interacción entre dímeros para la formación del tetrámero de Pfk-2. Por su parte, el residuo Cys-238 está localizado en una región alejada del sitio activo, de la interface del dímero y de la del tetrámero. Considerando estos resultados en conjunto, se desprenden las siguientes proposiciones: (1) el estado dimérico de Pfk-2 es esencial para estabilidad y la actividad catalítica de la enzima, (2) el residuo Cys-238 no participa en la interacción monómero-monómero de la enzima, como se había sugerido por los estudios de modificación diferencial con sondas químicas y, (3) el residuo Cys-295 afecta las propiedades del sito activo, la estabilidad del dímero y aumenta la fuerza de interacción entre dímeros en el tetrámero de la Pfk-2.
Abstract:
The binding of MgATP to an allosteric site in the homodimeric phosphofructokinase-2 (Pfk-2) from E. coli drives to the inhibition of enzymatic activity and the association of dimers into tetramers. Chemical modification of Cys-238 in Pfk-2 with pyrene maleimide resulted in an active monomeric enzyme which converts into dimers in the presence of the substrates. On the other hand, eosine maleimide-modified Pfk-2 on Cys-295 resulted in an inactive dimeric enzyme which is unable to form tetramers in the presence of MgATP. These data suggested a role for Cys-238 on the maintenance of the dimeric structure and a role for Cys-295 on catalysis and tetramer formation of Pfk-2. In order to evaluate the proposed roles for Cys-238 and Cys-295 in the structure and function of Pfk-2, these residues were mutated to alanine and phenylalanine (Ala and Phe, respectively) and the effects over kinetics, ligand binding, and stability of Pfk-2 were determined. Also, we establish a correlation between these effects and the location of both residues on the dimeric and tetrameric models of Pfk-2. Mutations on Cys-238 result in no effects over kinetic parameters with respect to wild type enzyme. However, changing Cys-295 for Ala or Phe produced a 2 to 7 fold decrease in the kcat and 3 to 6 fold increment in the Km for both substrates. There is a correlation between the properties of the loss of enzymatic activity and dimer dissociation in guanidinium chloride-induced unfolding and protein dilution experiments. Although no differences can be observed between the properties of Cys-238 mutants and wild type enzyme, a less stable and more sensitive dimer to protein dilution is seen when Cys-295 is replaced by Phe. These results suggest that the dimeric state is required for enzymatic activity and that Cys-238 residue is not affecting the monomer-monomer interactions that contribute to dimer stability, as is seen with the Cys-295 residue. All the Cys-238 and Cys-295 mutants were inhibited by MgATP as the wild type enzyme. However, only the Cys-295-Phe mutant requires unusually high fructose-6-P concentrations (up to 5 mM) to relieve the MgATP-induced inhibition. This effect is probably due to the fact that the tetrameric (MgATP-bound) form of Cys-295-Phe is more stable to denaturation than the wild type or the other mutant enzymes, as demonstrated by guanidinium chloride-induced unfolding experiments carried out in the presence of 1 mM MgATP. Also, a slight increment in the Kd for fructose-6-P is observed as a consequence of mutations on Cys-295, in agreement with the increment observed for the Km of the sugar-phosphate in this mutant. These observations agree with the location of Cys-238 and Cys-295 in the molecular model of the Pfk-2 tetramer obtained using homology modelling and X-ray scattering. In the model, the Cys-295 residue is located near to both, the active site and dimer-dimer interface. Therefore, modification of this residue are expected to change the active site properties and subunit interactions. Since Cys-238 is far from the active site and monomer-monomer and dimer-dimer interfaces, mutants on this residue are not expected to affect enzymatic activity or dimer dissociation. Taken together, three conclusions can be drawn from the results obtained: (1) the dimeric state is essential for the stability and function of Pfk-2, (2) the Cys-238 residue is not a structural determinant of the dimeric state, as suggested by previous chemical modification experiments, and (3) the Cys-295 residue affects the active site properties, dimer stability and subunit interactions in the tetramer form of Pfk-2.
Palabras Clave:
fosfofructoquinasa-2; Escherichia coli; enzimas
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Caniuguir Ortega, Andrés Nilson
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2005/fcc223i/doc/fcc223i.pdf