Información detallada Tesis (Metadatos y Resúmenes)

Título:
Efecto de una mutación intrónica en la función del canal de cloruro CIC-2
Autor:
Yusef Robles, Manuel Yamil
Profesor Patrocinante:
Cid, Luis Pablo
Grado a Optar:
Biólogo Marino - Licenciado en Biología Marina
Materia:
epilepsia; canal de cloruro; splicing
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Biología Marina
Año de Aceptación:
2004
Resumen:
ClC-2, miembro de la familia de canales de cloruro ClC, se expresa en neuronas y células gliales, donde participaría en la homeostasis del cloruro intracelular la cual es determinante en la regulación de la excitabilidad neuronal. La exacerbación patológica de esta última es la base de la epilepsia y la falta de función en un canal que participe en la inhibición neuronal podría dar cuenta de dicha alteración. Haug y colaboradores (2003) encontraron una deleción de 11 pb en el intrón 2 del gen CLCN2, que co-segrega en pacientes con epilepsia idiopática generalizada de herencia autosomica dominante. Dicha deleción, ubicada cercana a la región aceptora, podría afectar el splicing normal del mRNA y llevar a una pérdida de función de ClC-2. Para estudiar lo anterior se sintetizaron minigenes (con y sin la deleción) y se transfectaron en 3 líneas celulares de origen diferente. La evaluación mediante RT-PCR demostró la existencia de 2 transcritos con y sin inclusión del exón 3 en una proporción similar e independiente del minigen transfectado. Luego, se realizó la deleción del exón 3 en hClC-2 (hClC-2 Δ74-117) y se analizó mediante expresión aguda en células HEK-293. Los estudios de patch clamp mostraron ausencia de corrientes y un nulo efecto del canal mutado sobre la función del silvestre cuando ambos fueron co-expresados, mientras que los estudios de microscopía confocal demostraron una ubicación preferentemente intracelular. En conclusión: a) la maquinaria de splicing pareciera no discriminar entre ambos minigenes en las tres líneas celulares usadas como modelo en nuestro estudio, b) la construcción hClC-2 Δ74-117 no produce corrientes debido a que esta no llega a la membrana plasmática y c) no existe efecto dominante negativo del canal mutado sobre la función y expresión del canal tipo silvestre.
Abstract:
ClC-2 is a member of the ClC chloride channels family. It’s expressed in neurons and glial cells, where it has been proposed participate in the intracellular chloride concentration homeostasis which affects neural excitability. The pathological increase of excitability is the base of epilepsy and the loss of function of a channel involved in neuronal inhibition could cause the disorder. A 11 base pair deletion in the CLCN2 gene second intron co-segregating with idiopathic generalized epilepsy in a dominant way of inheritance manner was found by Haug and colleagues (2003). The deletion, located near to the splicing acceptor site, could affect the splicing of the normal mRNA, leading to ClC-2 channel loss of function. To study this minigenes (with and without the deletion) were transfected in 3 cellular lines of different origin. RT-PCR experiments demonstrated the presence of 2 transcripts corresponding to the inclusion or not of the exon 3 in a similar proportion and independently of the transfected minigene. The deletion of the exon 3 was made in hClC-2 cDNA (hClC-2 Δ74-117) and was analyzed in acute expression en HEK-293 cells. The patch clamp studies established absence of chloride currents and no dominant negative effect when the wild type and mutant channels were co-expressed. Furthermore, confocal microscopy studies shown a prominent intracellular location of the mutant protein. In conclusion: a) the splicing machinery would not discriminate between both minigenes in the three cellular lines used as models in this study, b) the hClC-2 Δ74-117 construct does not reach the plasma membrane and nor generate sizable currents, c) there is not a dominant negative effect of the mutate channel upon the function and expression of the wild-type channel.
Palabras Clave:
epilepsia; canal de cloruro; splicing
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Yusef Robles, Manuel Yamil
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2004/fcy.95e/doc/fcy.95e.pdf