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Título:
Estudio metabólico en el bivalvo Perumytilus purpuratus: participación de la carboxiquinasa fosfoenolpirúvica en la utilización de la ruta anaeróbica del succinato-propionato
Autor:
Oelckers Gil, Karin Berta
Profesor Patrocinante:
Simpfendörfer, Robert
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
Perumytilus purpuratus; enzimas
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2004
Resumen:
Perumytilus purpuratus es un bivalvo marino habitual de nuestras costas. Presenta tolerancia a carencia de oxígeno, por lo cual se estudiaron en este trabajo sus capacidades fisiológicas y metabólicas de adaptación al hábitat intermareal, así como los mecanismos bioquímicos de respuesta a situaciones experimentales de carencia de oxígeno. Se observó que este organismo presenta elevada respiración aérea, respecto de su respiración en inmersión. De igual modo se comprobó que durante la emersión del bivalvo, la actividad de la enzima piruvato quinasa (PK) disminuyó en el tiempo, y se produjo un aumento de la actividad de la enzima carboxiquinasa fosfoenolpirúvica (PEPCK). Se observó acumulación de succinato en músculo aductor del bivalvo al ser expuesto a hipoxia. La enzima PEPCK de músculo aductor de P. purpuratus fue purificada a homogeneidad electroforética. El procedimiento de purificación constó de tres etapas: a) precipitación con sulfato de amonio, b) cromatografía en fosfocelulosa y c) cromatografía de afinidad en GTP-agarosa. La actividad específica de la enzima purificada fue de 13 U/mg (a 25 ºC); la enzima se purificó 252 veces, con un 28 % de rendimiento. La enzima nativa presentó una masa molecular de 89 kDa y en condiciones desnaturantes fue de 74 kDa, por lo tanto la enzima correspondería a un monómero. La reacción enzimática se midió en el sentido de la carboxilación del fosfoenolpiruvato (PEP). Los valores de Km aparente para los sustratos a pH 7, en presencia de 2,25 mM de MnCl2, fueron de 0,55 mM (PEP), 2,4mM (HCO3-) y 0,045 mM (IDP). El pH óptimo de la reacción fue de 6,6 y la enzima requiere para su actividad de la presencia de un metal bivalente, en el siguiente orden de efectividad: Co2+>Mn2+>Zn2+>Mg2+. En la enzima purificada se realizaron estudios de cisteínas funcionales utilizando el ácido ditio (bis)-nitrobenzoico (DTNB). La enzima fue inactivada en presencia de DTNB y la titulación de la enzima nativa sugirió la presencia de 3 cisteínas reactivas por monómero de enzima. En presencia del sustrato IDP/Mn2+ se observó protección de la inactivación por DTNB, lo cual, en conjunto con experimentos de cinética de inactivación por DTNB bajo condiciones de pseudoprimer orden, permite suponer que la pérdida de la actividad se debe a la modificación de una cisteína que estaría en (o cerca de) la región de unión del nucleótido. Los resultados sugieren elevadas capacidades de respuesta metabólica de P. purpuratus a situaciones ambientales de estrés hipóxico y que, además, la enzima PEPCK catalizaría a una etapa relevante en la discriminación del destino del fosfoenolpiruvato hacia vías metabólicas anaeróbicas como la del succinato-propionato en este invertebrado marino.
Abstract:
The marine bivalve Perumytilus purpuratus is a common inhabiting species of the chilean coastline. It is an anoxic-tolerant intertidal organism, and their physiological and metabolic adaptatory capacities, as well as the biochemical mechanisms of response to environmental conditions of lack of oxygen. were investigated in this study. It was observed that this organism shows a high aerial respiration, compared with immersed oxygen uptake. The muscular pyruvate kinase activity showed a marked decrease during emersion, and the phosphoenolpyruvate carboxykinase enzyme showed a clear increase on this tissue under experimental hypoxia. Accumulation of succinate was observed on adductor muscle of the bivalve after hypoxic / anoxic conditions. The adductor muscle PEPCK of the mussel P. purpuratus was purified to electrophoretic homogeneity. The purification procedure included three steps: a) ammonium sulfate precipitation, b) chromatography on phosphocellulose, c) affinity chromatography on GTPagarose. The specific activity of the purified enzyme was 13 U/mg (25 °C); the enzyme was purified 252-fold, with a yield of 28 %. The native molecular weight of the purified enzyme was 89 kDa, and of 74 kDa, by electrophoresis under denaturing conditions; the enzyme should therefore corresponds to a monomer. The enzymatic activity was measured in the direction of carboxylation of PEP. The Michaelis constant (app Km) values for the substrates (pH 7), in the presence of 2,25 mM MnCl2, were 0,55 mM (PEP), 2,4 mM (HCO3-), and 0,045 mM (IDP). The pH value for maximal PEPCK activity was 6,6, and the enzyme required a bivalent cation for activity, in the following order of efectiveness: Co2+>Mn2+>Zn2+>Mg2+. Functional cysteines were studied on the purified enzyme, utilizing the reagent dithio (bis)-nitrobenzoic acid (DTNB). The enzyme was inactivated in the presence of DTNB, and the titration of the native enzyme suggested the presence of 3 reactive cysteines / monomer of PEPCK. Protection from inactivation by DTNB was observed in the presence of the substrate IDP/Mn2+, indicating that the loss of enzymatic activity was due to the modification of one cysteine which would be located in (or near) the nucleotide binding region. The results presented here suggest high capacities of metabolic adaptation of P. purpuratus to environmental situations of hypoxic stress, and that the PEPCK enzyme should corresponds to a relevant step on the metabolic fate of PEP into anaerobic metabolism, like the succinatepropionate metabolic pathway on this marine invertebrate.
Palabras Clave:
Perumytilus purpuratus; enzimas
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Oelckers Gil, Karin Berta
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2004/fco.28e/doc/fco.28e.pdf