Información detallada Tesis (Metadatos y Resúmenes)

Título:
Estudios preliminares en capacitación in-vitro de espermatozoides ovinos frescos y congelados
Autor:
Merino González, Ricardo Antonio
Profesor Patrocinante:
Correa Soto, Jorge E.
Grado a Optar:
Médico Veterinario - Licenciado en Medicina Veterinaria
Materia:
semen conservación; criopreservación; in vitro; heparina; ovinos
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias Veterinarias
Escuela:
Escuela de Medicina Veterinaria
Año de Aceptación:
2003
Resumen:
El presente estudio se realizó con el propósito de lograr capacitación espermática in vitro de semen ovino fresco y congelado. Para esto se utilizaron 3 carneros adultos de 2 a 3 años de edad, mantenidos en estabulación permanente y alimentados principalmente con heno de pradera natural, concentrado y agua ad-libitum. Para evaluar las características seminales se obtuvo 12 eyaculados de cada carnero mediante vagina artificial, con una frecuencia de recolección de 3 veces por semana. Se estableció volumen, concentración espermática, porcentaje de espermatozoides vivos, porcentaje de espermatozoides morfológicamente anormales, movimiento de masa y movimiento progresivo. Los resultados obtenidos fueron: volumen de 1,1±0,39 ml., concentración de 3.476±740 espermatozoides/ml., 74,3% de espermatozoides vivos, movimiento progresivo de 74,3%±7,5, movimiento de masa de 3,6±0,9 y 12,8% de anormalidades. Todos los valores obtenidos se encuentran dentro del rango normal reportado por otros autores para carneros adultos sanos. Posteriormente, se desarrolló un protocolo de criopreservación de semen. El semen recolectado se diluyó en Tris, glucosa, yema de huevo y glicerol a una concentración de 400 millones de espermatozoides por ml. Las dosis fueron almacenadas en pajuelas Minitüb® de 0.25 ml. Antes de ser congeladas en nitrógeno líquido, las pajuelas fueron sometidas a un periodo de estabilización de dos horas a 5°C. El método de criopreservación aplicado permitió la recuperación de un 58% de células espermáticas vivas y una motilidad progresiva del 56%post-descongelación. La incubación y selección espermática (swim-up) se realizó simultáneamente durante dos horas en medio m-DM con 50 ug/ml de heparina en una estufa a 38,5 °C. Para esto, alícuotas de semen fueron puestas bajo el medio de incubación en 4 tubos para semen fresco y 6 tubos para semen descongelado para realizar la migración espermática hacia la superficie. Finalmente el sobrenadante fue recolectado y centrifugado a 500g por cinco minutos. Del pellet resultante se tomaron alícuotas de 20 ul para realizar frotis y la triple tinción nigrosina-eosina-Giemsa (NEG) con la cual se determinó la relación de espermatozoides vivos-muertos y el estado de sus membranas acrosómicas. Se observó un aumento en la presentación de reacción acrosómica en los espermatozoides incubados en presencia de heparina con respecto a los controles incubados en las mismas condiciones pero sin heparina. Para el semen fresco este aumento fue de 32 a 52% siendo este valor estadísticamente significativo (p<0.05). Pese a que los resultados obtenidos para el semen criopreservado carecen de significancia estadística (p>0.05), igualmente se observó una mayor presentación de reacción acrosómica con respecto al grupo control, aumentando de 41 a 46%. En conclusión los resultados obtenidos muestran que la adición de heparina (50ug/ml) al medio de incubación, aumentó la presentación de reacción acrosómica en semen fresco y en menor grado en semen criopreservado, hecho que es atribuible al aumento de la población espermática que experimentó capacitación durante el tratamiento.
Abstract:
This study was carried out with the purpose of achieving in vitro sperm capacitation of fresh and frozen ram semen. For this work three mature rams from 2 to 3 years old maintained indoors were used. Previous to the development of the investigation, the rams were trained for two weeks to the acceptance of the artificial vagina. To study the seminal characteristics, 12 eyaculate per ram were obtained with a frequency of three time per week. Volume, sperm concentration, percentaje of living spermatozoa, percentaje of abnormal spermatozoa, mass and progresive movements were recorded. Later, a protocol of cryopreservation of was stablished, by means of which thawed semen of good quality was obtained to carry out the experiment. Semen was diluted in a concentration of 400x106 spermatozoa/ml, stored in 0.25 ml. Minitübe® straws. The composition of the extender used was: Tris, glucose, egg yolk and glicerol. Before being frozen in liquid nitrogen the straws were subjected to a period of equilibration of two hours at 5°C. A 58% of live spermatozoa with 56% of progressive post-thaw movement was obtained with the cryoprotection method used. The incubation and sperm selection were carried out simultaneously, during two hours in m-DM culture media with 50 ug/ml of heparin at 38,5°C. Aliquots of fresh and thawed semen were put in the bottom of four tubes (fresh semen) and six tubes (thawed semen), under the incubation media in order to obtain sperm migration toward the surface (swim-up). Finally the upperlayer was gathered and centrifuged at 500 g by 5 minutes. Aliquots of 20 ul were taken from the pellet to carry out frotis and triple-stain nigrosin-eosin-Giemsa (NEG) with which the relationship of living-dead spermatozoa was determined and the state of its acrosomic membrane. The smear were observed in a optical microscope with a magnifying of 100 x and inmersion oil. There was an increase in the percentage of acrosome reacted spermatozoa from 32 to 52% in fresh semen showing statistically significant differences from the control group (p<0.05), although there was no statistically significant differences (p>0.05) in thawed semen increase from 41 to 46%. The results indicate that when ram semen is incubated in media with heparin there was an increase in the percentage of acrosome reacted spermatozoa and the percentage of capacitated spermatozoa.
Palabras Clave:
criopreservación; semen; ovino; reacción acrosómica; capacitación espermática; heparina
Palabras Clave:
cryopreservation; semen; ram; acrosome reaction; capacitation; heparin
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Merino González, Ricardo Antonio
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2003/fvm562e/doc/fvm562e.pdf