Información detallada Tesis (Metadatos y Resúmenes)

Título:
Estudio del mecanismo de apertura del canal de cloruro CIC-2 mediante mutación sitio dirigida en la C256A
Autor:
Zúñiga Hormazábal, Leandro Antonio
Profesor Patrocinante:
Cid, Luis Pablo
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
cloruros; mutación; genes; ADN
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2002
Resumen:
Los canales de cloruro tipo ClC son proteínas de membrana que participan en diversas funciones celulares y mutaciones en los genes que los codifican son causa de enfermedades. Para explicar el mecanismo por el cual estos canales se abren y cierran se propuso el modelo de doble cañón, basado en estudios en ClC-0 de T. marmorata. Según este modelo, existirían dos poros idénticos que se abren mediante compuertas rápidas independientes y una compuerta lenta común, ambas sensibles al potencial de membrana. El estudio del mecanismo de compuerta de ClC-2 presenta dificultades por su baja conductancia de canal único. Una forma alternativa de estudio es la mutación de aminoácidos potencialmente involucrados en dicho mecanismo. Pérdida de dependencia de potencial de la compuerta lenta, por mutaciones en la cisteína 212 del ClC-0 y la homóloga del ClC-1 humano (C277), han sido reportados previamente. En la presente tesis se muestran los resultados de la evaluación funcional de la mutación en la cisteína homóloga del canal ClC-2 (C256). Mediante la técnica de patchclamp, se estudiaron las propiedades electrofisiológicas relacionadas con el mecanismo de compuerta y de poro. Los resultados muestran un cambio de ~30 mV en la dependencia de potencial, un aumento de la probabilidad mínima de apertura en ~20 %, además de alterarse la cinética de apertura y cierre. La secuencia de permeabilidad del canal a diferentes aniones no se modificó. Estos resultados sugieren que la mutación C256 en ClC-2 pone de manifiesto al menos dos mecanismos de compuerta, uno de ellos homologable a la compuerta lenta descrita para ClC-0 y 1.
Abstract:
ClC-type chloride channels are membrane proteins that perform a variety cellular functions, and several mutations in their coding genes lead to disease. Based on previous investigation of ClC-0, a so-called double-barrelled model has been proposed to explain the channel voltage dependent opening and closing. In this model two identical pores are gated independently (fast gates) and a common slow gate controls both pores at the same time. In ClC-0 and ClC-1 a single point mutation of a conserved cysteine, C212 in ClC-0 and C277 in human ClC-1, has been shown to abolish or greatly reduce the contribution of the slow gate. This residue is conserved in ClC-2, a channel of ~50 % homology with ClC-0 and 1. The study of the gating mechanism of ClC-2 has been hampered by its low single-channel conductance. One way to approach the problem might be to attempt the molecular identification of the gate by site specific mutagenesis. In the present thesis a functional evaluation of a mutation in the conserved cysteine of ClC-2, which corresponds to C256 in the rat, is presented. The functional analysis was carried out using the patch-clamp technique, studying the gating and pore features. ClC-2C256A showed altered gating with a shift by ~30 mV of the voltagedependence curve. The minimum open probability was increased to about ~20 % and both opening and closing kinetics were affected. The pore properties were not altered as deduced from a study of the permeability sequence for different anions. These results suggest that in ClC-2 there are at least two gating mechanisms, one of which resembles the slow gating of ClC-0 and ClC-1.
Palabras Clave:
cloruros; mutación; genes; ADN
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Zúñiga Hormazábal, Leandro Antonio
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2002/fcz.95e/doc/fcz.95e.pdf