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Título:
Caracterización de proteínas fosforiladas en queratinocitos humanos secundaria a la estimulación de CD40
Autor:
Herrera Ardabán, Marcela Alejandra
Profesor Patrocinante:
Vidal, Alejandra
Grado a Optar:
Bioquímico - Licenciado en Bioquímica
Materia:
proteinas; fosforilación; queratinocitos
Universidad:
Universidad Austral de Chile
Facultad:
Facultad de Ciencias
Escuela:
Escuela de Bioquímica
Año de Aceptación:
2002
Resumen:
La diferenciación de los queratinocitos de la epidermis humana, está regulada por una variedad de estímulos externos y señales intracelulares que interactúan mediante complejos mecanismos. Aunque en su comprensión se han realizado importantes avances, muchas de estas señales y sus efectos continúan siendo poco conocidos. En el presente trabajo estudiamos en cultivos de queratinocitos humanos las señales intracelulares generadas por la conjugación de agonistas solubles a la molécula de membrana CD40. Para ello se aislaron queratinocitos a partir de biopsias de piel de pacientes sometidos a cirugía reparativa y se cultivaron en medio bajo en calcio. Este método permitió obtener células equivalentes a queratinocitos basales, los que fueron utilizados en todos los ensayos posteriores. Mediante western blotting se analizó la fosforilación de proteínas tirosina-dependiente en queratinocitos estimulados con agonistas solubles a CD40; Incluyendo anticuerpos monoclonales anti-CD40 y el trímero recombinante humano (hCD40L).Los anticuerpos EA-5 y en menor grado M89 indujeron la rápida fosforilación tirosina-dependiente, herbimicina y PMA sensible de péptidos de masa molecular aparente de 132 kDa. Además, hCD40L y M89 indujeron la translocación nuclear del factor transcripcional NFkB y la expreción de (pro)filagrina de forma dosis dependiente. Sin embargo, debido a que los agonistas empleados corresponden, con excepción del trímero hCD40L, a inmunoglobulinas, el empleo de IgG1 como control de la estimulación con agonistas solubles, podría permitir ratificar estos resultados. Estos resultados sugieren que la activación de CD40 por agonistas solubles induce en queratinocitos humanos proteínas fosforiladas en tresiduos de tirosina de alrededor de 132 kDa. y la translocación nuclear del factor transcripcional NF-kB, sugiriendo una posible vía de señales de transducción de CD40.
Abstract:
Keratinocyte differentiation in human epidermis is regulated by a variety of external stimulus and intracelular signals that interact through complex ecanisms. Even though there it has important advances in the comprehension of these mechanisms, many of these signals and their effects continue to be poorly understood. In this work, we studied the intracellular signals generated by the conjugation of soluble agonists to the CD40 membrane molecule in human keratinocyte cultures. To this purpose keratinocytes were isolated from skin biopsies from patients undergoing reparative surgery and cultured in low calcium medium. This method made it possible to obtain cells equivalent to basal keratinocytes, that which were used in all subsequent assays. Tyrosine-dependent protein phosphorylation was analyzed by means of Western blotting in keratinocytes stimulated with soluble agonists to CD40, including anti-CD40 monoclonal antibodies to CD40 and the human recombinant trimer (CD40L). EA-5 and with a lesser degree M89 antibodies, induced rapid tyrosine-dependent, herbimycin and PMA sensitive phosphorylation of peptides with an apparent molecular mass of 132 kDa. In addition, hCD40L and M89 induced nuclear translocation of the NFkB transcriptional factor; and, the expression of (pro)filaggrin in a dose-dependent manner. However, because, the agonists used correspond, to immunoglobulins, whith exception of the trimer hCD40L, the use of IgG1 as a control of the stimulation with soluble agonists, could enable to ratify this results. These results suggest that activation of CD40 by soluble agonists induce in human keratinocytes as a whole of 132 kDa. tyrosin phosphorylated proteins and nuclear translocation of NFkB transcriptional factor, suggesting a possible transduction pathway for CD40.
Palabras Clave:
proteinas; fosforilación; queratinocitos
Editor:
Universidad Austral de Chile - Sistema de Bibliotecas - Programa Cybertesis
Formato:
text/pdf
Idioma:
es
Copyright:
Herrera Ardabán, Marcela Alejandra
Dirección Electrónica:
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2002/fch565c/doc/fch565c.pdf